图1 TMEM138系统发育进化树
纸质出版日期:2024-03-25,
网络出版日期:2023-12-04,
收稿日期:2023-04-19,
录用日期:2023-11-02
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TMEM138是一种纤毛蛋白,其缺失会导致系统发育性纤毛病-Joubert综合征。为解析其致病的分子机制,本文对TMEM138进行了保守性分析和拓扑结构研究。选取8个代表性物种分析TMEM138蛋白一级、二级和三级结构的保守性,确定了TMEM138的跨膜结构域最为保守,是实现其功能的重要结构基础。通过构建TMEM138体外过表达载体并结合活细胞染色技术,首次验证了TMEM138的膜定位和其拓扑学结构,该结论可为TMEM138的研究提供进一步的帮助。
TMEM138 is a ciliary protein. Absence of TMEM138 can cause phylogenetic ciliopathy-Joubert syndrome. In order to analyze the molecular mechanism of TMEM138, the conservative analysis and topological structure of TMEM138 were studied. Eight representative species were selected to analyze the conserved primary, secondary and tertiary structure of TMEM138 protein, and determined that the transmembrane domain of TMEM138 is the most conserved, which is an important structural basis for realizing its function. By constructing the in vitro overexpression vector of TMEM138 and combining with the live cell staining technique, we verified the membrane localization and topological structure of TMEM138 for the first time. This conclusion can provide further help for the study of TMEM138.
纤毛是一种以微管为基础结构的细胞器,并被富含特定信号受体和离子通道的双层脂膜所包被,其具有运动、感知(光、压力等)等功能并且参与激素调节和各种信号级联的启动(Schnakenburg et al.,2007),调节细胞稳态和发育。大多数单细胞和多细胞真核生物都有纤毛,在脊椎动物中,纤毛存在于许多类型细胞的表面(
TMEM138在体内外的实验中已被证实定位于纤毛,是一种纤毛蛋白(
另外Joubert综合征有一定的基因和表型相关性,患有视网膜营养不良的Joubert综合征与AHI1、CEP290、TMEM216、TMEM138、INPP5E和CEP41的突变有关,而患有肝病的Joubert综合征与TMEM67、CC2D2A、rpgrip1l、CEP290和INPP5E的突变有关(
跨膜(TM,transmembrane)蛋白质是一个古老的蛋白质超家族,从线虫到哺乳动物都有保存。TMEM138即属于该蛋白家族,是一种跨膜蛋白。膜蛋白作为细胞间信号机制的关键组成部分在细胞中发挥重要作用,它们可以启动信号级联,介导多种离子和溶质的跨膜运输,并参与生物体对自我的识别,许多膜结合受体和通道已被反复证明是富有成效的疾病治疗靶点(van Geest et al.,2000)。每种跨膜蛋白都有特定的拓扑结构,这对于其蛋白功能的正确执行至关重要。膜拓扑是指膜蛋白的二维结构信息,指示跨膜结构域(TMD,transmembrane domain)的数量和可溶性结构域相对于膜平面的方向(
1.1.1 细胞
293T细胞(中山大学中山眼科中心汝佳丽博士赠予)。
1.1.2 主要试剂
PBS粉末(武汉博士德公司),PFA、Triton X-100(美国Sigma公司),驴血清、氨苄青霉素(大连美仑公司),琼脂糖(德国Biofroxx公司),EB(美国Gibco公司),胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒(北京天根公司),Trans5α感受态细胞、PBS溶液(北京全式金公司),限制性内切酶(大连Takara公司),LB液体培养基、LB Agar固体培养基(北京coolaber公司),DMEM高糖培养基、Opti-MEM培养基和Lipofectamine®3000(美国Thermo公司)。
1.1.3 主要抗体
Frizzle5(美国国家眼科研究所Tiansen Li博士惠赠),FLAG(F1804)购自美国Sigma公司,FLAG(Ab1162)购自英国abcam公司,HA(C29F4)购自美国Cell Signaling公司,HA(6E2)购自美国Cell Signaling公司。以上所有抗体的稀释比例均为1∶1 000。
1.1.4 仪器设备
PCR仪(德国Eppendorf公司),核酸凝胶成像分析仪(美国Bio-Rad公司),紫外可见光分光光度计(美国Thermo公司),离心机(德国Eppendorf公司),体式显微镜(日本Olympus公司),倒置荧光显微镜(德国Zeiss公司),激光共聚焦显微镜880(德国Zeiss公司)。
1.2.1 TMEM138系统发育树构建
从NCBI数据库获取13个代表物种的TMEM138基因参考序列,以下为种属名和对应物种TMEM138基因参考序列号: Homo sapiens(NM_016464.5),
Mus musculus(NM_028411.4),
Danio rerio(XM_002666770.5),
Bos taurus(XM_027532662.1),
Sus scrofa(XM_005660823.3),
Gallus gallus(NM_001277894.2),
Caenorhabditis elegans(NM_001026903.3),
Trachemys scripta elegans(XM_034767658.1),
Xenopus tropicalis( NM_001008081.1),
Loxodonta africana(XM_010599131.2),
Anolis carolinensis(XM_003224131.3),
Drosophila simulans(XM_002078255.4),
Drosophila melanogaster(NM_135128.3)。
使用MEGA11构建了TMEM138的Neighbor-joining进化树,进化距离使用最大复合似然法计算。
1.2.2 TMEM138蛋白多序列比对分析
从UniProt数据库下载8个代表物种的TMEM138蛋白序列,包括:
TMEM138_HUMAN(Q9NPI0),
Tmem138_MOUSE(Q9D6G5),
Tmem138_BOVIN(A5PJY4),
Tmem138_DANRE(E7FDE0),
Tmem138_XENTR(Q66JC0),
Tmem138_CHICK(A0A1D5PE71),
Tmem138_DROME(Q9VMK8),
Tmem138_CAEEL(Q7YX41)。
使用UniProt数据库的Align功能得到TMEM138蛋白ClustalW比对分析结果。
1.2.3 TMEM138蛋白Motif分析
使用在线Motif分析工具MEME(http: //meme-suite.org/tools/meme),对8个代表物种TMEM138进行Motif分析。并使用Tomtom工具将获得的Motif与已知的Motif数据库进行比对。
1.2.4 TMEM138蛋白三级结构预测
CHICK(Gallus gallus)的Tmem138三级结构模型的预测由QUARK(http://zhanglab.dcmb.med.umich.edu/QUARK/)提供支持。其余7个物种TMEM138三级结构预测模型来自AlphaFold蛋白质结构数据库。
1.2.5 TMEM138蛋白跨膜螺旋预测
使用TMHMM-2.0(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0)对8个代表物种TMEM138蛋白的跨膜螺旋位置进行预测。
1.2.6 构建TMEM138表达载体
设计同源臂引物并以cDNA为模板扩增TMEM138目的片段,待插入的分子标签经由引物合成,再通过DNA同源重组酶将目的片段与线性化的PRK5质粒载体相连,连接产物转化至trans5α感受态细胞后再进行抗生素筛选,最后留存测序正确的质粒。
1.2.7 细胞培养与转染
将293T细胞接种至铺有细胞爬片的24孔板中,待其汇合度为70% ~ 90%时开始转染,步骤参考Lipofectamine®3000试剂使用说明,转染前1 h给细胞换液,转染结束12 h后再次更换培养基,24 h后更换为减血清培养基对细胞进行血清饥饿或常规培养基持续培养。
1.2.8 活细胞染色
转染的细胞持续培养48 h后,弃去旧的培养基,加入预冷的DMEM稀释的一抗,4 ℃孵育1 h。孵育结束后用预冷的DMEM在4 ℃条件下洗去一抗,每次5 min,洗3次。预冷的PBS洗去残留的DMEM后,加入w=4% PFA室温固定细胞10 min。PBS洗3遍,每次5 min,去除残留的固定液,加入w=10%驴血清300 μL室温封闭30 min。封闭结束后加入w=10%驴血清稀释的二抗,室温避光孵育2 h。用φ=0.1% PBST洗去二抗,共洗3次,每次至少15 min。最后封片,待晾干后观察拍照。
为从生物进化的角度整体评估TMEM138的保守性,本研究广泛地选取了包括脊椎动物和无脊椎动物在内的13个代表物种,并使用MEGA11软件构建TMEM138基因Neighbor Joining系统发育进化树(
图1 TMEM138系统发育进化树
Fig.1 TMEM138 phylogenetic evolution tree
为分析TMEM138蛋白一级结构的保守性,本研究选取了包括了哺乳动物、脊椎动物和无脊椎动物在内的8个代表物种,对其TMEM138蛋白进行了多序列比对分析,以期从这些进化地位和物种分类截然不同的生物中归纳总结TMEM138的序列保守特征,结果见
图2 几种代表物种TMEM138多序列比对分析
Fig.2 TMEM138 mltiple sequence alignment analysis of several representative species
“*”代表性质完全一致的残基;“:”代表性质特别相近的残基;“.”代表性质微弱相近的残基。
蛋白Motif的预测和识别是研究蛋白质结构和功能的重要环节。本研究使用MEME分析不同物种的TMEM138蛋白序列,共获得了3个Motifs (
图3 几种代表物种TMEM138的Motif分析
Fig.3 Motif analysis of several representative species TMEM138
相同颜色的字母代表相同性质的氨基酸,字母的相对大小代表该氨基酸在序列中出现的频率,字母越大,频率越高,且代表该氨基酸的保守性越高。
蛋白质的生物学活性依赖于其三级结构。本研究使用AlphaFold对不同物种TMEM138的三级结构进行预测,预测的跨膜结构域的位置已标示(
图4 几种代表物种TMEM138三级结构预测
Fig.4 Tertiary structure prediction of several representative species TMEM138
本研究构建了6种不同的Tmem138表达载体,cDNA来自小鼠,分别标记了Tmem138蛋白N末端、C末端以及各跨膜区之间的结构域。将这些质粒分别与Fzd5(G蛋白偶联受体,标记细胞膜)质粒共转至293T细胞,进行活细胞染色实验,暴露于细胞膜表面的抗原将被染色。结果显示,Tmem138:N-Flag、Tmem138:C-Flag和Tmem138:TM2H3过表达的细胞中均显示Flag或HA在细胞膜的阳性染色,这些结果表明,Tmem138的N-末端和C-末端暴露于细胞膜外侧,跨膜拓扑方向为“W”型;与此相一致,Tmem138:TM1H2、Tmem138:TM3H4和Tmem138:TM1H2-3H4过表达的细胞中均未显示出阳性染色(
图5 Tmem138质粒在293T细胞中的活细胞染色
Fig.5 Live cell staining of Tmem138 plasmid in 293T cells
(a) Tmem138:N-Flag与Fzd5共转后的活细胞染色; (b) Tmem138:C-Flag与Fzd5共转后的活细胞染色;
(c) Tmem138:TM1H2与Fzd5共转后的活细胞染色; (d) Tmem138:TM2H3与Fzd5共转后的活细胞染色;
(e) Tmem138:TM3H4与Fzd5共转后的活细胞染色; (f) Tmem138:TM1H2-3H4与Fzd5共转后的活细胞染色,标尺:5 μm;(g) Flag、 HA阳性细胞的量化统计结果; (h) Tmem138膜拓扑示意图。
纤毛作为一种普遍存在的结构,在生物体的发育和生存中起着核心作用。因此,纤毛结构、成份的畸变或功能障碍都会导致广泛系统性的人类疾病。纤毛虽然是一个微小的结构,但是其蛋白组成却十分丰富,目前已鉴定出大约800种纤毛蛋白(
TMEM138突变引发的Joubert综合征可影响人的大脑、视网膜和生殖系统(
本研究通过对TMEM138的跨膜结构域进行预测,发现不同物种TMEM138都具有4个跨膜结构域,且在不同物种间对应跨膜结构域的位置和长度相似,这些结果也从另外的角度证明TMEM138在结构上具有保守性。通过对TMEM138跨膜结构域和保守结构综合分析,我们还发现TMEM138的保守氨基酸位点、Motif和alpha螺旋都集中分布在其跨膜区域,这表明TMEM138的跨膜结构域可能是其功能保守的关键,因此我们对其作为跨膜蛋白的重要性质——膜拓扑结构进行了验证。首先我们证明了TMEM138的膜定位,并且基于此进一步确定其拓扑结构为“W”型,即N-末端和C-末端均暴露于膜外侧,TM2和TM3之间延展区位于细胞膜外侧,TM1和TM2以及TM3和TM4之间延展区位于细胞膜内侧。TMEM138的拓扑结构是其作为膜蛋白正确执行蛋白功能的关键,也是实现其保守功能的基础。
关于TMEM138保守性和拓扑结构的研究,可能为一些相关研究提供帮助。TMEM138在体外培养的细胞水平被证实参与关联性囊泡运输(
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