纤毛蛋白TMEM138的保守性及拓扑结构

王冬新; 刘春巧

doi:10.13471/j.cnki.acta.snus.2023E024

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纤毛蛋白TMEM138的保守性及拓扑结构

研究论文 | 更新时间：2024-04-10

- 纤毛蛋白TMEM138的保守性及拓扑结构
- The conservation and topological structure of ciliary protein TMEM138
- 角色： First author , 第一作者 ,
  
  机构：
  眼科学国家重点实验室 / 中山大学中山眼科中心，广东广州 510623
  
  邮箱： wangdx25@mail2.sysu.edu.cn
  
  简介：王冬新（1996年生），女；研究方向：膜蛋白拓扑及蛋白互作网络；E-mail：wangdx25@mail2.sysu.edu.cn
  
  暂无本作者相关信息
  王冬新
  ，
  角色： Corresponding author , 通讯作者 ,
  
  机构：
  眼科学国家重点实验室 / 中山大学中山眼科中心，广东广州 510623
  
  邮箱： liuchunq3@mail.sysu.edu.cn
  
  简介：刘春巧（1970年生），男；研究方向：发育生物学；E-mail：liuchunq3@mail.sysu.edu.cn
  
  暂无本作者相关信息
  刘春巧
  ，
- 中山大学学报(自然科学版)(中英文) 2024年63卷第2期页码：131-138
- 作者机构：
  
  眼科学国家重点实验室 / 中山大学中山眼科中心，广东广州 510623
- 作者简介：
  
  王冬新（1996年生），女；研究方向：膜蛋白拓扑及蛋白互作网络；E-mail：wangdx25@mail2.sysu.edu.cn
  刘春巧（1970年生），男；研究方向：发育生物学；E-mail：liuchunq3@mail.sysu.edu.cn
- 基金信息：
  
  广州市科技计划重点专项(201707020009)
- DOI：10.13471/j.cnki.acta.snus.2023E024
  中图分类号： Q7
- 纸质出版日期：2024-03-25，
  
  网络出版日期：2023-12-04，
  
  收稿日期：2023-04-19，
  
  录用日期：2023-11-02
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王冬新,刘春巧.纤毛蛋白TMEM138的保守性及拓扑结构[J].中山大学学报(自然科学版)(中英文),2024,63(02):131-138.

WANG Dongxin,LIU Chunqiao.The conservation and topological structure of ciliary protein TMEM138[J].Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Sunyatseni,2024,63(02):131-138.
王冬新,刘春巧.纤毛蛋白TMEM138的保守性及拓扑结构[J].中山大学学报(自然科学版)(中英文),2024,63(02):131-138. DOI： 10.13471/j.cnki.acta.snus.2023E024.

WANG Dongxin,LIU Chunqiao.The conservation and topological structure of ciliary protein TMEM138[J].Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Sunyatseni,2024,63(02):131-138. DOI： 10.13471/j.cnki.acta.snus.2023E024.

摘要

TMEM138是一种纤毛蛋白，其缺失会导致系统发育性纤毛病-Joubert综合征。为解析其致病的分子机制，本文对TMEM138进行了保守性分析和拓扑结构研究。选取8个代表性物种分析TMEM138蛋白一级、二级和三级结构的保守性，确定了TMEM138的跨膜结构域最为保守，是实现其功能的重要结构基础。通过构建TMEM138体外过表达载体并结合活细胞染色技术，首次验证了TMEM138的膜定位和其拓扑学结构，该结论可为TMEM138的研究提供进一步的帮助。

译

Abstract

TMEM138 is a ciliary protein. Absence of TMEM138 can cause phylogenetic ciliopathy-Joubert syndrome. In order to analyze the molecular mechanism of TMEM138， the conservative analysis and topological structure of TMEM138 were studied. Eight representative species were selected to analyze the conserved primary， secondary and tertiary structure of TMEM138 protein， and determined that the transmembrane domain of TMEM138 is the most conserved， which is an important structural basis for realizing its function. By constructing the in vitro overexpression vector of TMEM138 and combining with the live cell staining technique， we verified the membrane localization and topological structure of TMEM138 for the first time. This conclusion can provide further help for the study of TMEM138.

译

关键词

TMEM138; 保守性分析; 膜拓扑结构

译

Keywords

TMEM138; conservation analysis; membrane topology

译

纤毛是一种以微管为基础结构的细胞器，并被富含特定信号受体和离子通道的双层脂膜所包被，其具有运动、感知（光、压力等）等功能并且参与激素调节和各种信号级联的启动（Schnakenburg et al.，2007），调节细胞稳态和发育。大多数单细胞和多细胞真核生物都有纤毛，在脊椎动物中，纤毛存在于许多类型细胞的表面（

Scholey，2003；Fuchs et al.，2004；Davenport et al.，2005）。基于纤毛功能的重要性和分布的广泛性，某些重要的纤毛基因缺失甚至会导致生物体死亡，例如在小鼠中全敲除DYNC2H1（编码动力蛋白2重链1），可致小鼠在胚胎发育期死亡，死亡原因不明确，但可以观察到神经管缺损、大脑开放、脊柱裂和骨缩短（Nonaka et al.，1998）。不考虑致死的极端情况，纤毛对人类健康影响最大的是被称为纤毛病的疾病，它是由纤毛结构、成分的畸变或功能障碍导致的一大类异质性疾病。

译

TMEM138在体内外的实验中已被证实定位于纤毛，是一种纤毛蛋白（

Li et al.，2016）。在人类中的研究表明，TMEM138的缺失可导致名为Joubert综合征的纤毛病，该种Joubert综合征可影响人的大脑、视网膜和生殖系统（Ben-Salem et al.，2014；Brancati et al.，2010）。在小鼠中的研究表明，Tmem138的缺失可使小鼠出现早发快速的视网膜光感受器退化、脑积水引起的脑室扩张，以及精子缺陷等表型（Guo et al.，2022）；在斑马鱼中敲除Tmem138也可以导致其脑室扩张（Lee et al.，2012）。上述已发表的证据表明，TMEM138的缺失在多物种中可引发相似的表型，这暗示着TMEM138可能具有极为保守的蛋白结构和功能。因此，我们构建了TMEM138系统发育树，并对几种代表物种TMEM138蛋白结构上的保守性进行了生物信息学比对分析。

译

另外Joubert综合征有一定的基因和表型相关性，患有视网膜营养不良的Joubert综合征与AHI1、CEP290、TMEM216、TMEM138、INPP5E和CEP41的突变有关，而患有肝病的Joubert综合征与TMEM67、CC2D2A、rpgrip1l、CEP290和INPP5E的突变有关（

Keeny et al.，2014），即TMEM138是一种可以特定引起视网膜营养不良的人类纤毛基因。有新的研究表明，Tmem138定位于小鼠视网膜光感受器的连接纤毛，并且Tmem138敲除的小鼠会发生视网膜光感受器退化（Guo et al.，2022）。所以，我们对TMEM138蛋白的特定研究可能对揭示纤毛病相关的人类视觉疾病的机制具有重要意义。

译

跨膜（TM，transmembrane）蛋白质是一个古老的蛋白质超家族，从线虫到哺乳动物都有保存。TMEM138即属于该蛋白家族，是一种跨膜蛋白。膜蛋白作为细胞间信号机制的关键组成部分在细胞中发挥重要作用，它们可以启动信号级联，介导多种离子和溶质的跨膜运输，并参与生物体对自我的识别，许多膜结合受体和通道已被反复证明是富有成效的疾病治疗靶点（van Geest et al.，2000）。每种跨膜蛋白都有特定的拓扑结构，这对于其蛋白功能的正确执行至关重要。膜拓扑是指膜蛋白的二维结构信息，指示跨膜结构域（TMD，transmembrane domain）的数量和可溶性结构域相对于膜平面的方向（

Lee et al.，2014）。本研究通过构建带有特定标签的TMEM138表达载体，并结合4 ℃条件下的活细胞染色技术，确定了TMEM138的拓扑结构，以期为揭示TMEM138突变引发疾病的分子机理提供帮助。

译

1 材料与方法

1.1　实验材料

1.1.1　细胞

293T细胞（中山大学中山眼科中心汝佳丽博士赠予）。

译

1.1.2　主要试剂

PBS粉末（武汉博士德公司），PFA、Triton X-100（美国Sigma公司），驴血清、氨苄青霉素（大连美仑公司），琼脂糖（德国Biofroxx公司），EB（美国Gibco公司），胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒（北京天根公司），Trans5α感受态细胞、PBS溶液（北京全式金公司），限制性内切酶（大连Takara公司），LB液体培养基、LB Agar固体培养基（北京coolaber公司），DMEM高糖培养基、Opti-MEM培养基和Lipofectamine^®3000（美国Thermo公司）。

译

1.1.3　主要抗体

Frizzle5（美国国家眼科研究所Tiansen Li博士惠赠），FLAG（F1804）购自美国Sigma公司，FLAG（Ab1162）购自英国abcam公司，HA（C29F4）购自美国Cell Signaling公司，HA（6E2）购自美国Cell Signaling公司。以上所有抗体的稀释比例均为1∶1 000。

译

1.1.4　仪器设备

PCR仪（德国Eppendorf公司），核酸凝胶成像分析仪（美国Bio-Rad公司），紫外可见光分光光度计（美国Thermo公司），离心机（德国Eppendorf公司），体式显微镜（日本Olympus公司），倒置荧光显微镜（德国Zeiss公司），激光共聚焦显微镜880（德国Zeiss公司）。

译

1.2　实验方法

1.2.1　TMEM138系统发育树构建

从NCBI数据库获取13个代表物种的TMEM138基因参考序列，以下为种属名和对应物种TMEM138基因参考序列号： Homo sapiens（NM_016464.5），

译

Mus musculus（NM_028411.4），

译

Danio rerio（XM_002666770.5），

译

Bos taurus（XM_027532662.1），

译

Sus scrofa（XM_005660823.3），

译

Gallus gallus（NM_001277894.2），

译

Caenorhabditis elegans（NM_001026903.3），

译

Trachemys scripta elegans（XM_034767658.1），

译

Xenopus tropicalis（ NM_001008081.1），

译

Loxodonta africana（XM_010599131.2），

译

Anolis carolinensis（XM_003224131.3），

译

Drosophila simulans（XM_002078255.4），

译

Drosophila melanogaster（NM_135128.3）。

译

使用MEGA11构建了TMEM138的Neighbor-joining进化树，进化距离使用最大复合似然法计算。

译

1.2.2　TMEM138蛋白多序列比对分析

从UniProt数据库下载8个代表物种的TMEM138蛋白序列，包括：

译

TMEM138_HUMAN（Q9NPI0），

译

Tmem138_MOUSE（Q9D6G5），

译

Tmem138_BOVIN（A5PJY4），

译

Tmem138_DANRE（E7FDE0），

译

Tmem138_XENTR（Q66JC0），

译

Tmem138_CHICK（A0A1D5PE71），

译

Tmem138_DROME（Q9VMK8），

译

Tmem138_CAEEL（Q7YX41）。

译

使用UniProt数据库的Align功能得到TMEM138蛋白ClustalW比对分析结果。

译

1.2.3　TMEM138蛋白Motif分析

使用在线Motif分析工具MEME（http： //meme-suite.org/tools/meme），对8个代表物种TMEM138进行Motif分析。并使用Tomtom工具将获得的Motif与已知的Motif数据库进行比对。

译

1.2.4　TMEM138蛋白三级结构预测

CHICK（Gallus gallus）的Tmem138三级结构模型的预测由QUARK（http：//zhanglab.dcmb.med.umich.edu/QUARK/）提供支持。其余7个物种TMEM138三级结构预测模型来自AlphaFold蛋白质结构数据库。

译

1.2.5　TMEM138蛋白跨膜螺旋预测

使用TMHMM-2.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？TMHMM-2.0）对8个代表物种TMEM138蛋白的跨膜螺旋位置进行预测。

译

1.2.6　构建TMEM138表达载体

设计同源臂引物并以cDNA为模板扩增TMEM138目的片段，待插入的分子标签经由引物合成，再通过DNA同源重组酶将目的片段与线性化的PRK5质粒载体相连，连接产物转化至trans5α感受态细胞后再进行抗生素筛选，最后留存测序正确的质粒。

译

1.2.7　细胞培养与转染

将293T细胞接种至铺有细胞爬片的24孔板中，待其汇合度为70% ~ 90%时开始转染，步骤参考Lipofectamine®3000试剂使用说明，转染前1 h给细胞换液，转染结束12 h后再次更换培养基，24 h后更换为减血清培养基对细胞进行血清饥饿或常规培养基持续培养。

译

1.2.8　活细胞染色

转染的细胞持续培养48 h后，弃去旧的培养基，加入预冷的DMEM稀释的一抗，4 ℃孵育1 h。孵育结束后用预冷的DMEM在4 ℃条件下洗去一抗，每次5 min，洗3次。预冷的PBS洗去残留的DMEM后，加入w=4% PFA室温固定细胞10 min。PBS洗3遍，每次5 min，去除残留的固定液，加入w=10%驴血清300 μL室温封闭30 min。封闭结束后加入w=10%驴血清稀释的二抗，室温避光孵育2 h。用φ=0.1% PBST洗去二抗，共洗3次，每次至少15 min。最后封片，待晾干后观察拍照。

译

2 结果

2.1　TMEM138系统发育进化树构建

为从生物进化的角度整体评估TMEM138的保守性，本研究广泛地选取了包括脊椎动物和无脊椎动物在内的13个代表物种，并使用MEGA11软件构建TMEM138基因Neighbor Joining系统发育进化树（

Saitou et al.，1987），进化距离用最大似然法计算（Tamura et al.，2004），并按比例绘制了辐射树（图1），比例绘制的分支长度的单位与用来推断系统发育树的进化距离的单位相同，图1中的分支节点表示发生生物进化事件的节点。结果显示，人类TMEM138基因独立进化的时间相对较短，与其他哺乳类生物发生进化事件的时间接近，与卵生的脊椎动物如禽类、爬行类、两栖类等生物发生进化事件的时间则相距渐远。秀丽隐线虫（Caenorhabditis elegans）和果蝇（Drosophila simulans）Tmem138基因独立进化的时间最长，与人类亲缘关系最远。

译

图1 TMEM138系统发育进化树

Fig.1 TMEM138 phylogenetic evolution tree

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2.2　TMEM138多序列比对分析

为分析TMEM138蛋白一级结构的保守性，本研究选取了包括了哺乳动物、脊椎动物和无脊椎动物在内的8个代表物种，对其TMEM138蛋白进行了多序列比对分析，以期从这些进化地位和物种分类截然不同的生物中归纳总结TMEM138的序列保守特征，结果见图2。图2显示，人、小鼠、牛、斑马鱼、非洲爪蟾、鸡的TMEM138有162个氨基酸，而果蝇和线虫TMEM138的氨基酸数量则分别为165和176个。与人类TMEM138相比，这些种属中牛的同源性最高（94.4%）、小鼠为91.9%、鸡为84.6%、非洲爪蟾为69.7%、斑马鱼为68.5%、果蝇和线虫的同源性较低分别为30.3%和27.8%。总体上，上述几个物种TMEM138共同保守的氨基酸数量为21个，加上有同类替代和性质相似相对保守的氨基酸数量为65个。为进一步了解这些保守氨基酸在TMEM138中的位置信息，我们对上述物种的TMEM138蛋白进行了跨膜结构域的预测。结果显示，这些物种的TMEM138蛋白皆为四次跨膜蛋白，跨膜结构域的位置已在多序列比对结果中标注。值得关注的是，各物种TMEM138高度保守的氨基酸集中在其跨膜结构域所在的序列中。

译

图2 几种代表物种TMEM138多序列比对分析

Fig.2 TMEM138 mltiple sequence alignment analysis of several representative species

“*”代表性质完全一致的残基；“：”代表性质特别相近的残基；“.”代表性质微弱相近的残基。

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2.3　TMEM138蛋白Motif分析

蛋白Motif的预测和识别是研究蛋白质结构和功能的重要环节。本研究使用MEME分析不同物种的TMEM138蛋白序列，共获得了3个Motifs （图3），按从高到低的置信度顺序排序（

Bailey et al.，1994）。Motif 1序列长度为41个氨基酸残基，是所有物种中TMEM138蛋白最保守的区域，在这些物种中都存在。Motif 2序列长度为41个氨基酸残基，Motif 3序列长度为50个氨基酸残基，它们在脊椎动物中是保守的。将预测的跨膜结构域位置在Motif分析结果中标注，结果显示每个Motif均包含一个跨膜区域，Motif 3除包含第1个跨膜区还包含部分第2个跨膜区。上述结果提示TMEM138蛋白功能相对保守，并且保守结构和跨膜结构域相关。

译

图3 几种代表物种TMEM138的Motif分析

Fig.3 Motif analysis of several representative species TMEM138

相同颜色的字母代表相同性质的氨基酸，字母的相对大小代表该氨基酸在序列中出现的频率，字母越大，频率越高，且代表该氨基酸的保守性越高。

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2.4　TMEM138三级结构预测

蛋白质的生物学活性依赖于其三级结构。本研究使用AlphaFold对不同物种TMEM138的三级结构进行预测，预测的跨膜结构域的位置已标示（图4）。其中HUMAN三级结构的平均建模置信度为86.40、MOUSE为87.39、BOVIN为87.90、DANRE为89.57、XENTR为86.43、DROME 82.13、CAEEL为88.34，这些蛋白的平均建模置信度都接近90，代表建模结果可信。从预测结果来看，不同物种TMEM138的空间构象相似，在预测的4个跨膜结构域都具有alpha螺旋，该结果提示TMEM138的三级结构具有保守性。

译

图4 几种代表物种TMEM138三级结构预测

Fig.4 Tertiary structure prediction of several representative species TMEM138

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2.5　Tmem138拓扑结构验证

本研究构建了6种不同的Tmem138表达载体，cDNA来自小鼠，分别标记了Tmem138蛋白N末端、C末端以及各跨膜区之间的结构域。将这些质粒分别与Fzd5（G蛋白偶联受体，标记细胞膜）质粒共转至293T细胞，进行活细胞染色实验，暴露于细胞膜表面的抗原将被染色。结果显示，Tmem138：N-Flag、Tmem138：C-Flag和Tmem138：TM2H3过表达的细胞中均显示Flag或HA在细胞膜的阳性染色，这些结果表明，Tmem138的N-末端和C-末端暴露于细胞膜外侧，跨膜拓扑方向为“W”型；与此相一致，Tmem138：TM1H2、Tmem138：TM3H4和Tmem138：TM1H2-3H4过表达的细胞中均未显示出阳性染色（图5a~f）。进一步的量化统计分析显示，N-末端的标记的细胞数比C-末端多（图5g），这可能是由于载体表达效率或HA抗体效价不同导致。我们证明了Tmem138的膜定位，并且验证了其N-末端和C-末端及TM2和TM3之间延展区位于细胞膜外侧的拓扑结构（图5h）。

译

图5 Tmem138质粒在293T细胞中的活细胞染色

Fig.5 Live cell staining of Tmem138 plasmid in 293T cells

(a) Tmem138：N-Flag与Fzd5共转后的活细胞染色； (b) Tmem138：C-Flag与Fzd5共转后的活细胞染色；

(e) Tmem138：TM3H4与Fzd5共转后的活细胞染色； (f) Tmem138：TM1H2-3H4与Fzd5共转后的活细胞染色，标尺：5 μm；(g) Flag、 HA阳性细胞的量化统计结果； (h) Tmem138膜拓扑示意图。

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3 讨论

纤毛作为一种普遍存在的结构，在生物体的发育和生存中起着核心作用。因此，纤毛结构、成份的畸变或功能障碍都会导致广泛系统性的人类疾病。纤毛虽然是一个微小的结构，但是其蛋白组成却十分丰富，目前已鉴定出大约800种纤毛蛋白（

Gherman et al.，2006；Ishikawa et al.，2012）。对于另外一些高度修饰的纤毛来说，其蛋白组成更加丰富，例如对小鼠视网膜光感受器外段和连接纤毛蛋白组学的综合研究，共鉴定出约2 000种蛋白，其中大部分蛋白用于支持其独特的光转导功能而存在（Liu et al.，2007）。尽管纤毛蛋白的数量十分丰富，但某一种蛋白的缺失就可以破坏其功能并引发疾病，TMEM138及其同家族的基因TMEM237、TMEM67、TMEM231、TMEM216等已被证实在突变后可引起Joubert综合征（Keeny et al.，2014）。由此可见，这些跨膜蛋白对于纤毛功能的正确执行发挥着重要作用，理解TMEM138的结构和功能可能是解析Joubert综合征分子机制的重要一步。

译

TMEM138突变引发的Joubert综合征可影响人的大脑、视网膜和生殖系统（

Brancati et al.，2010），在小鼠中敲除Tmem138也能产生与人类几近相同的表型（Guo et al.，2022），在斑马鱼里敲低该基因可以引起脑室扩张（Lee et al.，2012）。这些证据表明，在不同物种间TMEM138的功能可能是高度保守的，故而我们从进化和结构上对TMEM138的保守性进行了生物信息学分析。从构建的TMEM138系统发育树的结果来看，TMEM138的进化与生物进化的趋势一致，斑马鱼Tmem138与人类TMEM138如同两物种的进化地位一样，进化距离相当远，但却在缺失后引发相似性状，由此可见TMEM138功能的保守。在进一步对TMEM138结构的保守性分析中，我们发现在不同物种TMEM138的一、二、三级结构中分别存在着高度保守的氨基酸、高度保守的Motif和相似的空间构象。这些在不同物种TMEM138中都保留着的保守结构，很可能是为TMEM138实现其特定保守的蛋白功能而存在。

译

本研究通过对TMEM138的跨膜结构域进行预测，发现不同物种TMEM138都具有4个跨膜结构域，且在不同物种间对应跨膜结构域的位置和长度相似，这些结果也从另外的角度证明TMEM138在结构上具有保守性。通过对TMEM138跨膜结构域和保守结构综合分析，我们还发现TMEM138的保守氨基酸位点、Motif和alpha螺旋都集中分布在其跨膜区域，这表明TMEM138的跨膜结构域可能是其功能保守的关键，因此我们对其作为跨膜蛋白的重要性质——膜拓扑结构进行了验证。首先我们证明了TMEM138的膜定位，并且基于此进一步确定其拓扑结构为“W”型，即N-末端和C-末端均暴露于膜外侧，TM2和TM3之间延展区位于细胞膜外侧，TM1和TM2以及TM3和TM4之间延展区位于细胞膜内侧。TMEM138的拓扑结构是其作为膜蛋白正确执行蛋白功能的关键，也是实现其保守功能的基础。

译

关于TMEM138保守性和拓扑结构的研究，可能为一些相关研究提供帮助。TMEM138在体外培养的细胞水平被证实参与关联性囊泡运输（

Lee et al.，2012），在对小鼠的研究中，发现Tmem138与光感受器纤毛胞质蛋白AHI1和视紫红质蛋白（Rho，Rhodopsin）等膜蛋白都有相互作用，可能参与这些膜蛋白在光感受器内的运输，这些是Tmem138敲除小鼠视网膜病变的重要原因（Guo et al.，2022）。我们对Tmem138膜拓扑结构的研究可能对于揭示这些蛋白互作模式和小鼠视网膜病变的分子机制提供帮助，从而为解决相关的人类疾病奠定基础。

译

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摘要

Abstract

in vitro

overexpression vector of TMEM138 and combining with the live cell staining technique， we verified the membrane localization and topological structure of TMEM138 for the first time. This conclusion can provide further help for the study of TMEM138.

关键词

TMEM138保守性分析膜拓扑结构

Keywords

TMEM138conservation analysismembrane topology

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